发布部门: 国家食品药品监督管理局
发布文号: 国食药监许[2011]96号
1 范围
本方法规定了采用液相色谱-串联质谱法测定化妆品中丙烯酰胺单体（cas：79-06-1）的方法。
本方法适用于化妆品中丙烯酰胺单体含量的测定。
2 方法提要
样品经过提取后，用液相色谱-串联质谱法测定，以多反应离子监测模式进行监测，采用特征离子丰度比进行定性，丙烯酰胺与内标峰面积比定量。本方法对丙烯酰胺的检出限为0.00005 µg，定量下限为0.0002 µg；若取0.2 g样品测定，本方法对丙烯酰胺的检出浓度为0.005 mg/kg，最低定量浓度为0.025 mg/kg。
3 试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 丙烯酰胺，纯度 ≥ 99.0 %。
3.2 氘代丙烯酰胺（2，3，3-d3），纯度 ≥ 98 %。
3.3 醋酸铵。
3.4 乙腈，色谱纯。
3.5 甲醇，色谱纯。
3.6 空白化妆品样品：选择不含丙烯酰胺的化妆品作为空白样品。
3.7 乙腈溶液[φ（乙腈）= 10%]：量取10 ml乙腈（3.4）置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
3.8 醋酸铵溶液[c（醋酸铵）= 0.02 mol/l]：称取醋酸铵0.08 g，置50 ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得浓度约为0.02 mol/l的醋酸铵溶液。
3.9 丙烯酰胺标准储备溶液[r（丙烯酰胺）= 0.5 g/l]： 称取丙烯酰胺标准品（3.1）50 mg（精确到0.1 mg）置100 ml量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.5 g/l的丙烯酰胺标准储备溶液。
3.10丙烯酰胺系列标准溶液：按照表1操作，分别精密量取一定体积的丙烯酰胺标准储备溶液（3.9）置10 ml量瓶中，以乙腈溶液（3.7）稀释并定容至刻度，得不同浓度的丙烯酰胺系列标准溶液。
3.11内标工作溶液：称取氘代丙烯酰胺标准品10 mg（精确到0.1 mg）置100 ml量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为100 μg/ml的氘代丙烯酰胺储备溶液，然后精密量取氘代丙烯酰胺储备溶液1ml置50 ml量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为2 μg/ml的氘代丙烯酰胺内标工作溶液。
3.12 丙烯酰胺加入空白样品标准溶液：取空白化妆品样品6份，每份约0.20 g（精确至0.001 g）于5 ml塑料离心管中，分别加浓度为2 μg/ml的内标溶液50 μl，涡旋30 s，再分别加丙烯酰胺系列标准溶液50 μl，涡旋30 s；然后加0.15 ml 0.02 mol/l的醋酸铵水溶液，涡旋30 s。再加2.0 ml乙腈，涡旋60 s后，以10000 rpm离心转速10 min，取上清液，氮气吹干，残渣加2 ml色谱流动相复溶，涡旋60 s，以10000 rpm转速离心5 min，取上清液， 经0.45 μm微孔滤膜过滤后，滤液作为待测液，备用，使得每克样品中含有丙烯酰胺0.025 μg、0.05 μg、0.25 μg、 1.25 μg、12. 5 μg、25 μg。
4 仪器
4.1 液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪。
4.2 分析天平：感量0.0001 g。
4.3 超声波清洗仪。
4.4 高速离心机。
4.5 精密移液器。
4.6 涡旋振荡器。
5 分析步骤
5.1 样品预处理
称取样品0.20 g （精确至0.001 g），置5 ml塑料离心管中，加浓度为2 μg/ml的内标溶液50 μl， 涡旋30 s；然后加0.15 ml 0.02 mol/l的醋酸铵水溶液，涡旋30 s，再加2.0 ml乙腈，涡旋60 s后，以10000 rpm转速离心10 min，取上清液，氮气吹干，残渣加2 ml色谱流动相复溶，涡旋60 s，以10000 rpm转速离心5 min，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，滤液作为待测液，备用。
5.2 液相色谱-三重串联四极杆质谱联用分析条件
5.2.1 色谱参考条件
色谱柱：waters atlantis t3（3.5 μm， 2.1 × 100 mm）或具有同等柱效的色谱柱；
流动相：甲醇＋0.1%甲酸水溶液 = 1.5＋98.5，恒度洗脱3 min；
流速：0.3 ml/min；
柱温：25 ℃；
进样量：5 μl。
5.2.2 质谱参考条件
离子源： 电喷雾离子源（esi源）；
监测模式： 正离子监测模式； 监测离子对及相关电压参数设定见表2；
雾化气压力： 50 psi；
干燥气流速： 12 l/min；
干燥气温度： 350 ℃；
毛细管电压： 4000 v；
0 - 1 min：不进入质谱仪分析， 1 - 2.5 min：进入质谱仪分析。
5.3 定性判定
用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定，如果检出的色谱峰的保留时间与标准品相一致，并且所选择的监测离子对的相对丰度比与标准样品的离子对相对丰度比相一致（见表3），则可以判断样品中存在丙烯酰胺。
5.4 定量测定
在“5.2”项液相色谱-三重四极杆质谱联用分析条件下，用丙烯酰胺加入空白样品的系列浓度的标准溶液（3.12）分别进样，以丙烯酰胺加入空白样品的系列浓度为横坐标，丙烯酰胺与内标的峰面积比为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，其线性相关系数应 > 0.99。取“5.1”项下处理得到的样品待测溶液进样5 μl，将丙烯酰胺与内标的峰面积比代入标准曲线，计算丙烯酰胺的质量浓度，按“6 计算”，计算样品中丙烯酰胺的含量。
5.5 平行实验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
6 计算（略）
7 回收率和精密度
两个浓度水平的平均提取回收率在85 - 110%，并且rsd小于8％（n=6），平均方法回收率在96.6 - 106％之间，并且rsd小于8％（n=6）。
表1 丙烯酰胺系列标准溶液的配制
表2 三重四级杆离子对及相关电压参数设定表
表3 监测离子和离子相对丰度比
8 色谱图（略）
发布文号: 国食药监许[2011]96号
1 范围
本方法规定了采用液相色谱-串联质谱法测定化妆品中丙烯酰胺单体（cas：79-06-1）的方法。
本方法适用于化妆品中丙烯酰胺单体含量的测定。
2 方法提要
样品经过提取后，用液相色谱-串联质谱法测定，以多反应离子监测模式进行监测，采用特征离子丰度比进行定性，丙烯酰胺与内标峰面积比定量。本方法对丙烯酰胺的检出限为0.00005 µg，定量下限为0.0002 µg；若取0.2 g样品测定，本方法对丙烯酰胺的检出浓度为0.005 mg/kg，最低定量浓度为0.025 mg/kg。
3 试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 丙烯酰胺，纯度 ≥ 99.0 %。
3.2 氘代丙烯酰胺（2，3，3-d3），纯度 ≥ 98 %。
3.3 醋酸铵。
3.4 乙腈，色谱纯。
3.5 甲醇，色谱纯。
3.6 空白化妆品样品：选择不含丙烯酰胺的化妆品作为空白样品。
3.7 乙腈溶液[φ（乙腈）= 10%]：量取10 ml乙腈（3.4）置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
3.8 醋酸铵溶液[c（醋酸铵）= 0.02 mol/l]：称取醋酸铵0.08 g，置50 ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得浓度约为0.02 mol/l的醋酸铵溶液。
3.9 丙烯酰胺标准储备溶液[r（丙烯酰胺）= 0.5 g/l]： 称取丙烯酰胺标准品（3.1）50 mg（精确到0.1 mg）置100 ml量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.5 g/l的丙烯酰胺标准储备溶液。
3.10丙烯酰胺系列标准溶液：按照表1操作，分别精密量取一定体积的丙烯酰胺标准储备溶液（3.9）置10 ml量瓶中，以乙腈溶液（3.7）稀释并定容至刻度，得不同浓度的丙烯酰胺系列标准溶液。
3.11内标工作溶液：称取氘代丙烯酰胺标准品10 mg（精确到0.1 mg）置100 ml量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为100 μg/ml的氘代丙烯酰胺储备溶液，然后精密量取氘代丙烯酰胺储备溶液1ml置50 ml量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为2 μg/ml的氘代丙烯酰胺内标工作溶液。
3.12 丙烯酰胺加入空白样品标准溶液：取空白化妆品样品6份，每份约0.20 g（精确至0.001 g）于5 ml塑料离心管中，分别加浓度为2 μg/ml的内标溶液50 μl，涡旋30 s，再分别加丙烯酰胺系列标准溶液50 μl，涡旋30 s；然后加0.15 ml 0.02 mol/l的醋酸铵水溶液，涡旋30 s。再加2.0 ml乙腈，涡旋60 s后，以10000 rpm离心转速10 min，取上清液，氮气吹干，残渣加2 ml色谱流动相复溶，涡旋60 s，以10000 rpm转速离心5 min，取上清液， 经0.45 μm微孔滤膜过滤后，滤液作为待测液，备用，使得每克样品中含有丙烯酰胺0.025 μg、0.05 μg、0.25 μg、 1.25 μg、12. 5 μg、25 μg。
4 仪器
4.1 液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪。
4.2 分析天平：感量0.0001 g。
4.3 超声波清洗仪。
4.4 高速离心机。
4.5 精密移液器。
4.6 涡旋振荡器。
5 分析步骤
5.1 样品预处理
称取样品0.20 g （精确至0.001 g），置5 ml塑料离心管中，加浓度为2 μg/ml的内标溶液50 μl， 涡旋30 s；然后加0.15 ml 0.02 mol/l的醋酸铵水溶液，涡旋30 s，再加2.0 ml乙腈，涡旋60 s后，以10000 rpm转速离心10 min，取上清液，氮气吹干，残渣加2 ml色谱流动相复溶，涡旋60 s，以10000 rpm转速离心5 min，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，滤液作为待测液，备用。
5.2 液相色谱-三重串联四极杆质谱联用分析条件
5.2.1 色谱参考条件
色谱柱：waters atlantis t3（3.5 μm， 2.1 × 100 mm）或具有同等柱效的色谱柱；
流动相：甲醇＋0.1%甲酸水溶液 = 1.5＋98.5，恒度洗脱3 min；
流速：0.3 ml/min；
柱温：25 ℃；
进样量：5 μl。
5.2.2 质谱参考条件
离子源： 电喷雾离子源（esi源）；
监测模式： 正离子监测模式； 监测离子对及相关电压参数设定见表2；
雾化气压力： 50 psi；
干燥气流速： 12 l/min；
干燥气温度： 350 ℃；
毛细管电压： 4000 v；
0 - 1 min：不进入质谱仪分析， 1 - 2.5 min：进入质谱仪分析。
5.3 定性判定
用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定，如果检出的色谱峰的保留时间与标准品相一致，并且所选择的监测离子对的相对丰度比与标准样品的离子对相对丰度比相一致（见表3），则可以判断样品中存在丙烯酰胺。
5.4 定量测定
在“5.2”项液相色谱-三重四极杆质谱联用分析条件下，用丙烯酰胺加入空白样品的系列浓度的标准溶液（3.12）分别进样，以丙烯酰胺加入空白样品的系列浓度为横坐标，丙烯酰胺与内标的峰面积比为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，其线性相关系数应 > 0.99。取“5.1”项下处理得到的样品待测溶液进样5 μl，将丙烯酰胺与内标的峰面积比代入标准曲线，计算丙烯酰胺的质量浓度，按“6 计算”，计算样品中丙烯酰胺的含量。
5.5 平行实验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
6 计算（略）
7 回收率和精密度
两个浓度水平的平均提取回收率在85 - 110%，并且rsd小于8％（n=6），平均方法回收率在96.6 - 106％之间，并且rsd小于8％（n=6）。
表1 丙烯酰胺系列标准溶液的配制
| 工作溶液 | 溶液初始浓度 | 量取体积 | 定容终体积 | 标准溶液终浓度 |
| 标准溶液1 | （0.5 mg/ml） | 2 ml | 10 ml | 100 μg/ml |
| 标准溶液2 | （0.5 mg/ml） | 1 ml | 10 ml | 50 μg/ml |
| 标准溶液3 | （50 μg/ml） | 1 ml | 10 ml | 5μg/ml |
| 标准溶液4 | （5μg/ml） | 2 ml | 10ml | 1 μg/ml |
| 标准溶液5 | （1 μg/ml） | 2 ml | 10 ml | 0.2 μg/ml |
| 标准溶液6 | （1 μg/ml） | 1 ml | 10 ml | 0.1 μg/ml |
表2 三重四级杆离子对及相关电压参数设定表
| 编号 | 物质名称 | 母离子（m/z） | frag.（v） | 子离子（m/z） | ce（v） |
| 1 | 丙烯酰胺 | 72 | 40 | 55 | 8 |
| 2 | 氘代丙烯酰胺（内标） | 75 | 40 | 58 | 8 |
表3 监测离子和离子相对丰度比
| 监测离子对（m/z） | 离子相对丰度比（%） | 允许相对偏差（%） |
| 72-55 | 100 | |
| 72-44 | 应用标准品测定离子相对丰度比 | ±50 |
| 72-27 | 应用标准品测定离子相对丰度比 | ±50 |
8 色谱图（略）
