发布部门: 上海市农业委员会
发布文号: 沪农委[2011]42号
市兽药饲料检测所：
为加强动物源细菌耐药性监测工作，保证动物性食品安全，促进畜牧业健康发展，维护人民群众身体健康，根据农业部《关于下达2011年动物源细菌耐药性监测计划的通知》（农医发[2011]5号）的要求，结合本市实际，现将《2011年上海市动物源细菌耐药性监测计划》（见附件1）印发给你所，并就有关事项通知如下：
一、根据农业部《2011年动物源细菌耐药性监测计划》和本市工作安排，2011年度对本市10个标准化养殖场和10个小型养殖场进行生物样品采集，鉴定出大肠杆菌375株，沙门氏菌或金黄色葡萄球菌55株，并测定其耐药性（mic）。
二、市农委畜牧兽医办负责组织本市动物源细菌耐药性监测组织实施工作。市兽药饲料检测所负责本市动物源细菌耐药性监测的采样、分离纯化、鉴定测定、数据汇总分析上报和数据库建设与管理工作。
三、为保证动物源细菌抗菌剂细菌耐药性采样具有代表性和可追溯性，检测结果具有科学性和公正性，采样和检测单位需执行以下规定：
（一）市兽药饲料检测所的采样、细菌分离和鉴定、耐药性检测和结果上报等活动要按照《2011年度动物源细菌耐药性监测采样、检测技术要点》（附件2，简称《操作要点》）执行。
（二）样品应从养殖场（包括养鸡场、养猪场、奶牛场、屠宰厂、孵化场）抽取，其中规模化养殖场和小型养殖场各占50%。
（三）市兽药饲料检测所应同时做好养殖场用药情况和饲料来源调查，认真填写《采样记录表》（附件3）。一般情况下，每个养殖场填一份《采样记录表》，对同一养殖场用药情况不同的动物群，应分别填写采样表格。
（四）每一份采样记录表对应填写一份《耐药性检测结果统计表》（附件4）。
（五）大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的分离和鉴定按照《动物源细菌分离和鉴定方法》（附件5）或参照相关国标执行。
（六）检测和判断标准按照《抗菌药敏感性试验标准操作规程和判断标准》（附件6）执行。
（七）确证方法按照国际公认的《临床和实验室标准化委员会》（clsi）执行标准执行。
（八）实行检测结果以电子版和纸质并行上报方式。其中，电子版直接登录中国兽药信息网（www.ivdc.gov.cn），在中国兽药数据库下，选择耐药性监测数据库，输入本单位用户名和密码，打开后直接输入检测结果上报。纸质采样记录和结果统计报表应按统一格式填报。
四、市兽药饲料检测所要高度重视，精心组织，按要求向中国兽医药品监察所即时上报电子版检测结果。纸质检测结果报表应在2011 年11月底前上报中国兽医药品监察所和市农委畜牧兽医办，并将工作中存在的问题和建议及时反馈中国兽医药品监察所和市农委畜牧兽医办。
上海市农业委员会
2011年3月14日
附件1：
2011年上海市动物源细菌耐药性监测计划
表1：采样与细菌的分离
注：1、同一养殖场采样时，应对不同饲养阶段的动物分别采样；对鸡的采样应该为雏鸡和成鸡，对猪的应为仔猪和架子猪，每一阶段的动物采样50份左右。
2、采样与细菌的分离：采样和分离的方法按附件2、5进行；采样的动物种类、动物场和数量、分离细菌数量要求见表1。
3、细菌鉴定：分别对分离株按附件5进行大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌鉴定。必要时进行血清学测定。
4、细菌的耐药性测定：分别对分离的每种菌株按附件6对14种药做耐药性测定。
附件2：
2011年度动物源耐药性监测的采样、检测技术要点
一、采样
1. 采样地点选择
中国兽医药品监察所在全国范围内选取7个左右省市的16个左右养殖场；中国动物卫生与流行病学中心选取3个左右省市的12个左右养殖场；辽宁、上海、成都、广东和青岛五省市耐药性监测实验室在本省市（或周围地区）选择鸡场6个、猪场5个（规模化养殖场和小型养殖场各占一半）。本年度大肠杆菌的耐药性监测采样要求在各实验室在前几年耐药性监测基础上，每个实验室应选择5～6个养殖场，定点、定季度跟踪采样监测。
2. 采样类型
利用棉花拭子采泄殖腔（禽）和肛门（猪、牛）作大肠杆菌、沙门氏菌和弯曲杆菌分离，或从孵化后期死亡鸡胚采样分离沙门氏菌。选择奶牛场1-2个，采取新鲜牛奶分离金黄色葡萄球菌，根据养殖场规模，每个场采样30-50份。
3. 病原检测种类
本年度动物源细菌检测种类包括前几年监测的大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和本年度新增加的弯曲杆菌。病原菌沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可根据各地采样、细菌分离情况任选其一进行监测，也可同时进行。
二、认真做好饲料来源和饲料药物添加剂调查、采样前动物抗菌药使用情况调查（预防用药和治疗用药）和样品统计，据实填写采样记录表。
三、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲菌的分离鉴定
采用特殊培养基，定向做大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲菌分离，用生化试验、pcr技术或血清学方法对分离物进行鉴定，尽早进行弯曲杆菌分离鉴定技术培训。本年度要求每个省级实验室分离大肠杆菌不少于300株（鸡场200株，猪场分离100株），沙门氏菌或金黄色葡萄球菌不少于30株，弯曲杆菌不少于50株。中国兽医药品监察所分离大肠杆菌不少于500株（鸡场300株，猪场分离200株），沙门氏菌不少于50株，金葡菌不少于30株，弯曲杆菌不少于100株。将分离到的菌株-20℃以下加甘油保护剂冷冻保存或其它合适方法保存。
四、耐药性测定
用微量肉汤稀释法（附件3），测定肠道菌、金黄色葡萄球菌对临床13种常用抗菌药物的耐药性（注意肠道菌、金黄色葡萄球菌的测试药物各有不同），弯曲杆菌统一送中国兽医药品监察所指导耐药性检测。将测定结果正确填入耐药性检测结果统计表（附件6）。药物种类、判断标准及质控菌株的质控范围见附件3，试验用标准品、质控菌株由中国兽医药品监察所统一供应。
五、结果报送
各地方动物源耐药性监测实验室的采样情况和耐药性检测结果，应填入采样记录表（附件5）和耐药性检测结果登计表（附件6）统一报送中国兽医药品监察所，经统计分析后上报农业部兽医局。
结果的上报分电子版和纸质2部分，电子版直接登陆“物源细菌耐药性数据库”上报。纸质结果的上报主要是监测结果总结，要求统一格式、同一内容。主要内容分6部分阐述：（1）本年度任务简述；（2）细菌分离情况；（3）耐药性监测情况；（4）耐药性监测结果分析；（5）存在问题；（6）改进措施和建议。
附件3
采样记录表
采 样 地：___________ _____ 养 殖 场：_________ ____ ___
采样时间：__________ ____ 联系人姓名、电话：________________ __
注：a为喂奶猪或保温鸡，b为保育猪或生长鸡，c为育成猪或鸡，d为种母猪或产蛋鸡。
附件4
耐药性检测结果统计表
（1）肠道菌耐药性检测结果统计表 养殖场： 检测员： 年 月 日
注：直接填写检测的mic数值。
（2）金葡菌耐药性检测结果统计表 养殖场： 检测员： 年 月 日
注：直接填写检测的mic数值。
附件5
动物源细菌分离和鉴定方法
一、大肠杆菌、沙门氏菌的分离和鉴定
1.范围
本方法规定了用于耐药性测定的动物源大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定方法。
本方法适用于各种动物及其组织中大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定。
2.设备和材料
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：37℃±1℃和42℃。
2.3 显微镜：10×--100×。
2.4 采样管。
2.5 采样棉拭子、剪子。
2.6 灭菌试管。
2.7 平皿。
2.8 自动细菌鉴定仪。
2.9 api 20e试子条。
2.3 恒温摇床
2.4 冻存管
3.培养基和试剂
3.1 运送培养基
3.2 麦康凯琼脂
3.3 沙门氏菌显色琼脂或xlt4琼脂
3.4 营养肉汤
3.5 鉴定用大肠杆菌、沙门氏菌阳性血清
3.6 四硫磺酸盐增菌液（ttb）
4.大肠杆菌和沙门氏菌分离和鉴定程序
大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定程序见图1
动物泄殖腔拭子用接种环接种于麦康凯琼脂按1：10接种四硫磺酸盐增菌液（ttb）42℃24h 运送培养基或营养肉汤发病动物带菌组织（做成匀液）挑取大肠杆菌可疑菌落纯化氧化酶试验（阴性）沙门氏菌显色培养基或xlt4琼脂挑取沙门氏菌可疑菌落纯化 api 20e试条自动细菌鉴定仪大肠杆菌沙门氏菌检测inva基因确认三糖铁（tsi）和硫化物吲哚运动性培养基（sim）鉴定沙门氏菌大肠杆菌
5.操作步骤
5.1 采样
到已选定的养殖场或屠宰场，用灭菌棉签采动物泄殖腔样品，置入1-2ml肉汤或运送培养基中0-4℃保存。采发病动物组织时，用无菌操作取少量动物组织至于灭菌试管内，0-4℃保存，不超过48小时。
5.2 大肠杆菌的分离
5.2.1 取泄殖腔拭子样品用接种棒直接接种于麦康凯琼脂平面，动物组织样品首先制成匀液，然后用接种棒接种于麦康凯琼脂平面，37℃培养18-24小时。
5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的大肠杆菌可疑菌落，用麦康凯培养基纯化一代，然后接种于营养琼脂平面37℃培养12-24小时，待进一步细菌鉴定。
5.3 沙门氏菌的分离
5.3.1 将泄殖腔拭子或制成匀液的动物组织样品与增菌培养基按1：10的比例，接种于ttb增菌液中，42℃培养24小时。
5.3.2 将增菌液摇匀，用接种环接种于沙门氏菌显色培养基37℃培养22-24小时或xlt4琼脂上42℃培养22-24小时。
5.3.3 将沙门氏菌显色培养基上紫色的沙门氏菌可疑菌落或xlt4琼脂培养基上中央黑色边沿透明的沙门氏菌可疑菌落接种于营养琼脂平面37℃培养16-24小时，待进一步细菌鉴定。
5.4 大肠杆菌和沙门氏菌的鉴定（以下方法可任选其一）
5.4.1 api 20e试验条鉴定
5.4.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4 .1.2 将待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，用api 20e试子条按照使用说明书（附注2）操作，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养18-24小时，用细菌鉴定仪判读结果。
5.4.1.3 将鉴定出的大肠杆菌和沙门氏菌结冻保存，待进行药敏试验。
5.4.2 其它方法
5.4.2.1 大肠杆菌的鉴定
5.4.2.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4.2.1.2 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于三糖铁（tsi）琼脂中，37℃培养22-24小时，观察结果应表面黄色，h2s阴性，产气。
5.4.2.1.3 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于硫化物吲哚运动性培养基（sim），37℃培养22-24小时，观察结果应产气，h2s阴性，运动或不运动，吲哚阳性。
5.4.2.2 沙门氏菌的鉴定：设计inva基因的引物，上游为5′-gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa-3′，下游为5′-tca tcg cac cgt caa agg aac c -3′，反应条件：95℃预变性5min，94ºc 30s， 64ºc 30s， 72ºc 30s for 30 cycles，得到扩增长度为284 bp的扩增产物为沙门氏菌阳性。
附注1：氧化酶试验
1.原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素c的存在有关。
2.方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（10g/l盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/l盐酸二甲基对苯二胺水溶液）1滴，1min内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试验。
3.结果判定：阳性者立即变粉红色，5～10s内呈深紫色。阴性为无色。
4.注意事项： ①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/l盐酸四甲基对苯二胺或10g/l盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。
附注2：api 20e使用说明书
1.试子条的准备：将5ml蒸馏水或软化水注入培养盒底部的蜂窝小凹中，造成一个湿盒。
2.在盘的长边写上菌株号，，再将试条放入盒中。
3.取新鲜菌落1个悬浮于0.85%的生理盐水5ml中，按照要求用滴管滴加到试条中，cit、vp、gel试验滴满管部和杯部，其它试验仅滴满管部（注意滴加时小心，不能产生气泡）。
4.adh、ldc、odc、h2s、ure试验用矿物油覆盖，以造成厌气环境。
盖好盒盖，于37℃培养18-24小时。
5.试条判读：根据判读表判读所有反应（阳性或阴性），①如果有3个或3个以上试验为阳性，在报告单上记录结果后，观察还需要附加试剂的试验结果：tda试验、ind试验、vp试验，然后判读结果。②如果阳性结果少于3个，继续培养24小时，再进行判定。
6.结果判定：每3个试验为1组，阳性按顺序赋予1、2、4的数值，根据试子条上20个反应可得到一个7位数的编码（氧化酶反应作为第21个反应），根据数据库（v4.1）得到鉴定结果。也可将试子条直接插入计算机鉴定系统，直接得到结果。
二、金黄色葡萄球菌的分离鉴定
1.范围
本方法规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。
本方法适用于牛奶和发病动物组织中金黄色的分离和鉴定。
2.设备和材料
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：37℃±1℃和42℃。
2.3 显微镜：10×--100×。
2.4 采样管。
2.5 灭菌试管。
2.6 平皿。
2.7 自动细菌鉴定仪。
2.8 api staph试子条。
2.9 恒温摇床
2.10 冻存管
3.培养基和试剂
3.1 baird－parker琼脂
3.2 营养肉汤
3.3 营养琼脂
3.4 新鲜兔血浆
3.5 0.3%过氧化氢液
4.金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序
金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图2
2000-3000 rpm，15 min弃上清 baird－parker琼脂灰色或黑小菌落，周围淡色、透明 营养琼脂增菌 api staph拭条鉴定金葡菌牛奶血浆凝固酶试验凝固金葡菌触酶试验阳性 扁桃体、发病动物组织
5.操作步骤
5.1 采样
5.1.1 牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶2ml，置入灭菌小离心管中，0-4℃保存，不超过48小时。
5.1.2 动物组织样品：无菌操作取发病动物组织，0℃-4℃保存不超过48小时。
5.2 金黄色葡萄球菌的分离
5.2.1 分离培养
5.2.1.1 将采样得到的牛奶样品，以2000～3000 r/min离心15 min，弃上清，用灭菌接种环醮起沉淀划线接种于baird－parker平皿，36℃培养24小时。
5.2.1.2 无菌操作将发病动物组织直接划线，接种于baird－parker平皿，36℃培养24小时。
5.2.2 挑取圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈的可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。
5.3 金黄色葡萄球菌的鉴定（以下方法可任选其一）
5.3.1 api staph试条鉴定
5.3.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验（附注3），应为阳性。
5.3.1.2 将待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，用api staph试子条按照使用说明书（附注4）操作，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养18-24小时，用细菌鉴定仪判读结果。
5.3.1.3 将鉴定出的金黄色葡萄球菌结冻保存，待进行药敏试验。
5.3.2 血浆凝固酶试验法
5.3.2.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验（附注3），应为阳性。
5.4.2.2 吸取1∶4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉汤培养物或生理盐水悬液0.5ml（1个麦氏单位），振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
5.4.2.3 如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，判为阳性结果。
附注3：触酶试验
用接种环挑取新鲜待检菌的纯化菌落置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液1 滴，观察结果。滴加3%过氧化氢溶液后立即产生气泡的为阳性。
附注4：api staph试子条按照使用说明书
1.试子条的准备：将5ml蒸馏水或软化水注入培养盒底部的蜂窝小凹中，造成一个湿盒。
2.在盘的长边写上菌株号（不记在盖上，以免错放），再将试条放入盒中。
3.取在血琼脂或营养琼脂上培养18-24小时的新鲜纯化、经触酶试验阳性的菌落，悬浮于0.85%的生理盐水5ml中，使其浓度等于0.5麦氏单位，按照要求用滴管滴加到试条小管中，试验仅滴满管部（注意滴加时小心，不能产生气泡）。
4.adh、ure用矿物油滴加到杯部，以造成厌气环境。盖好盒盖，于35℃--37℃培养18-24小时。
5.试条判读：加入试剂，观察反应： vp测定、nit测定、pal测定按照要求滴加试剂后进行判读阴性或阳性。
6.根据判读表判读所有反应（阳性或阴性）。
7.结果判定：每3个试验为1组，阳性按顺序赋予1、2、4的数值，根据试子条上20个反应可得到一个7位数的编码（触酶反应作为第21个反应），根据数据库（v4.1）得到鉴定结果。也可将试子条直接插入计算机鉴定系统，直接得到结果。
附件6
抗菌药敏感性试验操作规程和判断标准
一、抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法）操作方法
1．目的
本操作方法用来规范微量肉汤稀释法测定肠道杆菌最小抑菌浓度（mic）的操作，并统一判定标准。
2．适用范围
本标准操作规程适用于按照微量肉汤稀释法进行肠道杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度的测定（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌除外）。
3．职责
进行该试验的检验员应当按照本标准操作规程进行。
4．试验依据与原理
微量肉汤稀释法测定细菌最小抑菌浓度是定量检测某一抗生素对细菌体外活性的一种标准方法。试验在制成一系列各种浓度的抗生素肉汤溶液中分别加入等量的一定浓度的菌液，过夜培养后，判读最小抑菌浓度（mic）。
5．材料、仪器与试剂的准备及基本要求
5.1 材料和仪器
5.1.1 操作室：操作室内设有能达到空气消毒的紫外灯。实验前后应用75%乙醇溶液擦拭操作台面及可能污染的死角，开启紫外灯杀菌1小时。
5.1.2 旋涡混合振荡器：可调速
5.1.3 恒温培养箱：35±2℃
5.1.4 灭菌试管、容量瓶、刻度吸管等。
5.1.5 园底96孔板、接种针或接种环（镍铬丝或一次性无菌塑料制品）。
5.1.6 无菌衣、裤、帽、口罩：用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替。
5.1.7 8头或12头移液器、吸头等
5.2 试剂与培养基
5.2.1 75%乙醇溶液
5.2.2 无菌0.9%氯化钠溶液
5.2.3 新洁尔灭（1：1000）溶液
5.2.4 营养琼脂培养基
5.2.5 水解酪蛋白肉汤（mueller-hinton broth medium，mh肉汤，含20-25 mg钙/ l，10-12.5mg镁/l）
5.2.5.1 10mg/ml ca2＋ 和mg2＋的配制
ca2＋的配制：3.68g cacl2·2h2o加入100ml三蒸水中，含量为10mg ca＋＋/ml，0.22µm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
mg2＋的配制：8.36g mgcl2·6h2o加入100ml三蒸水中，含量为10mg mg＋＋/ml，0.22µm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
5.2.5.2 使用时加入适量的ca2＋和mg2＋到mh肉汤中，使mh肉汤中ca2＋和mg2＋的含量分别为20-25 mg ca2＋/ l和10-12.5mg mg2＋/l。
5.2.7 抗菌药物：一般采用标准品或对照品
5.3 质控菌种
5.3.1 肠道菌质控菌株：大肠杆菌atcc 25922。
5.3.2 金葡菌质控菌株：金黄色葡萄球菌atcc 29213。
5.4 抗菌药物贮备液的制备
5.4.1抗菌药物的称量
计算公式：
w（mg）=
式中：w-称取抗菌药物的重量；
v-制备抗菌药物的溶液体积；
c1-制备抗菌药物的溶液浓度；
c2-抗菌药物的含量。
5.4.2 加入一定量的溶剂稀释至一定浓度。贮备液的浓度至少应为1280µg/ml，或最高测试浓度的10倍以上。
5.4.3 将抗菌药物贮备液分装于无菌小瓶中，最好置-70℃以下保存，有效期为半年。注意不能反复冻融。临用前从冰箱中取出，使融解并与室温一致。
5.5 0.5麦氏单位（mcfarland）标准比浊液或比浊计
药敏试验菌悬液的浊度，以baso4浊度液为标准，相当于0.5麦氏单位（mcfarland），按如下方法配制：
5.5.1 取0.048mol/l的氯化钡溶液（1.175%w/v，bacl2·2h2o）0.5ml，加至99.5ml 0.18mol/l的硫酸溶液（1%v/v）中，不断搅拌使成混悬液。
5.5.2 用1cm光路的吸收池，在625nm下测定6.2.1的溶液，0.5标准麦氏单位（mcfarland standard）的吸收度应为0.08～0.10。
5.5.3 取4～6ml硫酸钡混悬液，置与稀释菌悬液相同规格的具塞试管中，密封，室温避光保存。
5.5.4 临用前将标准比浊液在漩涡震荡器上混合均匀，如出现大颗粒，则需重新配制。放置后硫酸钡标准比浊液的浊度会产生变化，因此应每月进行更换。
6 测定步骤
6.1 分离单菌落
将质控菌株和测试菌株分别用四分划线法转种于营养琼脂平面，置37℃培养箱中培养，以得到单个纯菌落。
6.2 抗生素工作溶液的制备
将抗菌药物贮备液用m－h肉汤稀释至一定的工作浓度后，按2倍稀释法进一步稀释至一系列所需浓度（一般10个浓度梯度），然后按顺序用排枪点入96孔板中，每块板横向10个稀释度，每孔0.1ml，设阴性和阳性对照，可测8个细菌。
6.3 菌液制备
6.3.1 生长法
6.3.1.1 用接种环挑取营养琼脂斜面上的3～5个质控菌或供试菌单个纯菌落，加入无菌4～5ml肉汤（如胰酶消化大豆肉汤）的试管中。
6.3.1.2 置35～37℃培养箱中培养，一般为2～6小时，使培养后的菌液浓度达到或超过0.5标准麦氏单位。
6.3.1.3 将培养好的菌液与比浊液管置比色卡上对着光源比较，适当情况下可用无菌生理盐水或肉汤稀释菌悬液，使两者浊度一致，即菌悬液的浓度为0.5标准麦氏单位，在该浓度下质控菌株atcc 25922的菌液浓度为1～2×108cfu。也可采用分光光度计测定并调节菌液浊度。
6.3.2 直接制备菌液法
该法较生长法简便，用接种环挑取琼脂平板上培养16～18小时的3～5个单菌落，用无菌生理盐水或m-h肉汤稀释至0.5麦氏单位。
6.3.3 将调节至0.5麦氏单位的菌液用m-h肉汤或生理盐水稀释100倍，约5x105-106cfu/ml浓度。
6.3.4 取5x105-106cfu/ml浓度的菌液0.1ml分别加入含系列抗菌药物溶液的板中， 混匀，试管中最终抗菌药物的浓度为原稀释浓度的一半。
6.4 培养
将加有菌液和抗菌药物的板，置35℃培养箱中培养16～20小时。
6.5 结果测定
取出培养后的板，观察结果，以无菌生长的最低抗菌药物溶液的浓度为最低抑菌浓度（mic）。
6.6 结果判断
在质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围（附注1和2）的前提下，按判断标准（附注1和2）判断被检菌株的敏感性－敏感，中度敏感或耐药。对于只给出敏感判断标准的药物，只报告其是否敏感即可。
7．注意事项
7.1 冷冻或冻干菌株应培养两代后才可用于测定。
7.2 调整好浊度的菌液应于15分钟内稀释至工作浓度。
7.3 m-h肉汤的质量对试验结果的影响
7.3.1 m-h肉汤是常规药敏试验中的最佳培养基，含磺胺，甲氧苄啶和四环素抑制剂较少，能满足大多数快速生长的需氧菌或兼性厌氧菌的营养需求。
7.3.2 试验一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的ph值应为7.2～7.4。
7.3.3 有些生产商能直接提供已调节阳离子浓度的m-h肉汤，否则需用原子吸收光谱仪测定。
7.3.4 新鲜配制的培养基，应按规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，所选用的化学试剂均应为分析纯。
7.3.5 如分离的菌种不典型或试验结果前后不一致时，应对菌种进行重新鉴定或重新进行药敏测定。
8. 名词解释
8.1 敏感 （susceptibillity， s）：表明该菌株所致感染可以用推荐的抗菌药物剂量进行治疗，除非存在禁忌症。
8.2 中介（intermediate， i）：用抗菌药物mic浓度治疗菌株感染，可使血液和组织中药物浓度接近通常可达到的水平，而抗生素治疗的反应率可能低于敏感株。意味着药物生理浓度部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和β－内酰胺类）或可用高于正常剂量的药物进行治疗（β－内酰胺类）。该类还包括一个缓冲区，可防止微小的，未能控制的技术因素造成的结果解释错误，特别是对那些安全范围窄的药物。
8.3 耐药（resistance， r）：指按常规剂量使用，抗生素通常达到的全身浓度不能抑制其生长的菌株，和/或某些抗菌药物的抑菌圈直径在耐药机制范围，且临床治疗效果不可靠。
9．参考文献
9.1 performance standards for antimicrobial susceptibility testing；fifteenth informational supplement.clinical and laboratory standards institute.
9.2 performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals；approved standard-second edition. clinical and laboratory standards institute.
9.3 methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically； approved standard-sixth edition. clinical and laboratory standards institute.
附注1 肠道杆菌药敏判定标准
注： **表示参考其他判定标准.
附注2 金黄色葡萄球菌药敏判定标准
发布文号: 沪农委[2011]42号
市兽药饲料检测所：
为加强动物源细菌耐药性监测工作，保证动物性食品安全，促进畜牧业健康发展，维护人民群众身体健康，根据农业部《关于下达2011年动物源细菌耐药性监测计划的通知》（农医发[2011]5号）的要求，结合本市实际，现将《2011年上海市动物源细菌耐药性监测计划》（见附件1）印发给你所，并就有关事项通知如下：
一、根据农业部《2011年动物源细菌耐药性监测计划》和本市工作安排，2011年度对本市10个标准化养殖场和10个小型养殖场进行生物样品采集，鉴定出大肠杆菌375株，沙门氏菌或金黄色葡萄球菌55株，并测定其耐药性（mic）。
二、市农委畜牧兽医办负责组织本市动物源细菌耐药性监测组织实施工作。市兽药饲料检测所负责本市动物源细菌耐药性监测的采样、分离纯化、鉴定测定、数据汇总分析上报和数据库建设与管理工作。
三、为保证动物源细菌抗菌剂细菌耐药性采样具有代表性和可追溯性，检测结果具有科学性和公正性，采样和检测单位需执行以下规定：
（一）市兽药饲料检测所的采样、细菌分离和鉴定、耐药性检测和结果上报等活动要按照《2011年度动物源细菌耐药性监测采样、检测技术要点》（附件2，简称《操作要点》）执行。
（二）样品应从养殖场（包括养鸡场、养猪场、奶牛场、屠宰厂、孵化场）抽取，其中规模化养殖场和小型养殖场各占50%。
（三）市兽药饲料检测所应同时做好养殖场用药情况和饲料来源调查，认真填写《采样记录表》（附件3）。一般情况下，每个养殖场填一份《采样记录表》，对同一养殖场用药情况不同的动物群，应分别填写采样表格。
（四）每一份采样记录表对应填写一份《耐药性检测结果统计表》（附件4）。
（五）大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的分离和鉴定按照《动物源细菌分离和鉴定方法》（附件5）或参照相关国标执行。
（六）检测和判断标准按照《抗菌药敏感性试验标准操作规程和判断标准》（附件6）执行。
（七）确证方法按照国际公认的《临床和实验室标准化委员会》（clsi）执行标准执行。
（八）实行检测结果以电子版和纸质并行上报方式。其中，电子版直接登录中国兽药信息网（www.ivdc.gov.cn），在中国兽药数据库下，选择耐药性监测数据库，输入本单位用户名和密码，打开后直接输入检测结果上报。纸质采样记录和结果统计报表应按统一格式填报。
四、市兽药饲料检测所要高度重视，精心组织，按要求向中国兽医药品监察所即时上报电子版检测结果。纸质检测结果报表应在2011 年11月底前上报中国兽医药品监察所和市农委畜牧兽医办，并将工作中存在的问题和建议及时反馈中国兽医药品监察所和市农委畜牧兽医办。
上海市农业委员会
2011年3月14日
附件1：
2011年上海市动物源细菌耐药性监测计划
表1：采样与细菌的分离
| 检测单位 | 样品来源 | 采样地要求 | 采样部位 | 细菌数要求 |
| 市兽药饲料检测所 | 本市 | 养殖场、奶牛场或屠宰厂20个 | 泄殖腔拭子或动物组织、牛奶 | 大肠杆菌375株，沙门氏菌或金葡菌55株 |
注：1、同一养殖场采样时，应对不同饲养阶段的动物分别采样；对鸡的采样应该为雏鸡和成鸡，对猪的应为仔猪和架子猪，每一阶段的动物采样50份左右。
2、采样与细菌的分离：采样和分离的方法按附件2、5进行；采样的动物种类、动物场和数量、分离细菌数量要求见表1。
3、细菌鉴定：分别对分离株按附件5进行大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌鉴定。必要时进行血清学测定。
4、细菌的耐药性测定：分别对分离的每种菌株按附件6对14种药做耐药性测定。
附件2：
2011年度动物源耐药性监测的采样、检测技术要点
一、采样
1. 采样地点选择
中国兽医药品监察所在全国范围内选取7个左右省市的16个左右养殖场；中国动物卫生与流行病学中心选取3个左右省市的12个左右养殖场；辽宁、上海、成都、广东和青岛五省市耐药性监测实验室在本省市（或周围地区）选择鸡场6个、猪场5个（规模化养殖场和小型养殖场各占一半）。本年度大肠杆菌的耐药性监测采样要求在各实验室在前几年耐药性监测基础上，每个实验室应选择5～6个养殖场，定点、定季度跟踪采样监测。
2. 采样类型
利用棉花拭子采泄殖腔（禽）和肛门（猪、牛）作大肠杆菌、沙门氏菌和弯曲杆菌分离，或从孵化后期死亡鸡胚采样分离沙门氏菌。选择奶牛场1-2个，采取新鲜牛奶分离金黄色葡萄球菌，根据养殖场规模，每个场采样30-50份。
3. 病原检测种类
本年度动物源细菌检测种类包括前几年监测的大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和本年度新增加的弯曲杆菌。病原菌沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可根据各地采样、细菌分离情况任选其一进行监测，也可同时进行。
二、认真做好饲料来源和饲料药物添加剂调查、采样前动物抗菌药使用情况调查（预防用药和治疗用药）和样品统计，据实填写采样记录表。
三、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲菌的分离鉴定
采用特殊培养基，定向做大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲菌分离，用生化试验、pcr技术或血清学方法对分离物进行鉴定，尽早进行弯曲杆菌分离鉴定技术培训。本年度要求每个省级实验室分离大肠杆菌不少于300株（鸡场200株，猪场分离100株），沙门氏菌或金黄色葡萄球菌不少于30株，弯曲杆菌不少于50株。中国兽医药品监察所分离大肠杆菌不少于500株（鸡场300株，猪场分离200株），沙门氏菌不少于50株，金葡菌不少于30株，弯曲杆菌不少于100株。将分离到的菌株-20℃以下加甘油保护剂冷冻保存或其它合适方法保存。
四、耐药性测定
用微量肉汤稀释法（附件3），测定肠道菌、金黄色葡萄球菌对临床13种常用抗菌药物的耐药性（注意肠道菌、金黄色葡萄球菌的测试药物各有不同），弯曲杆菌统一送中国兽医药品监察所指导耐药性检测。将测定结果正确填入耐药性检测结果统计表（附件6）。药物种类、判断标准及质控菌株的质控范围见附件3，试验用标准品、质控菌株由中国兽医药品监察所统一供应。
五、结果报送
各地方动物源耐药性监测实验室的采样情况和耐药性检测结果，应填入采样记录表（附件5）和耐药性检测结果登计表（附件6）统一报送中国兽医药品监察所，经统计分析后上报农业部兽医局。
结果的上报分电子版和纸质2部分，电子版直接登陆“物源细菌耐药性数据库”上报。纸质结果的上报主要是监测结果总结，要求统一格式、同一内容。主要内容分6部分阐述：（1）本年度任务简述；（2）细菌分离情况；（3）耐药性监测情况；（4）耐药性监测结果分析；（5）存在问题；（6）改进措施和建议。
附件3
采样记录表
采 样 地：___________ _____ 养 殖 场：_________ ____ ___
采样时间：__________ ____ 联系人姓名、电话：________________ __
| 样品来源 | ||
| 猪 日龄 ____ 鸡 日龄 ____ 牛 日龄 ____其他________日龄 ____ | 消化道 呼吸道 泌尿生殖道 肝胆 脑 淋巴结 关节 奶样 皮肤 粪便 其他______________ | |
| 采样动物健康状况 养殖量 | ||
| 健康 发病及症状：____________________________ ________ 。 | ||
| 采样养殖场使用抗菌药情况 | ||
| 饲料来源、添加抗菌药种类 | 治疗用抗菌药种类 | |
| 样品分离菌株 | ||
| 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 链球菌 沙门氏菌 空肠弯曲杆菌其他__________________ | 菌株编号：注：菌株编号按照“菌种、来源-采样地、采样年月-菌株编号”的格式进行。如eb-l0701-0001，其中：e（大肠杆菌）b（牛）l（鲁）07（年）01（月）-0001（菌株编号）。菌种简写建议为：e（大肠杆菌）、s（沙门氏菌）、sa（金黄色葡萄球菌）、sc（链球菌）、c（空肠弯曲杆菌）动物简写建议为：b（牛）、p（猪）、c（鸡） | |
注：a为喂奶猪或保温鸡，b为保育猪或生长鸡，c为育成猪或鸡，d为种母猪或产蛋鸡。
附件4
耐药性检测结果统计表
（1）肠道菌耐药性检测结果统计表 养殖场： 检测员： 年 月 日
| 菌株编号 | 氨苄西林 | 阿莫西林/克拉维酸 | 头孢噻呋 | 庆大霉素 | 大观霉素 | 四环素 | 多西环素 | 氟苯尼考 | 磺胺异恶唑 | 复方新诺明 | 恩诺沙星 | 二氟沙星 | 多粘菌素e |
| am | a/c | eft | gm | spt | te | do | ffc | sf | sxt | enr | nor | pme | |
注：直接填写检测的mic数值。
（2）金葡菌耐药性检测结果统计表 养殖场： 检测员： 年 月 日
| 菌株编号 | 青霉素 | 氨苄西林 | 阿莫西林/克拉维酸 | 头孢西丁 | 头孢噻呋 | 红霉素 | 磺胺异恶唑 | 复方新诺明 | 克林霉素 | 替米考星 | 恩诺沙星 | 氧氟沙星 | 万古霉素 |
| p | am | a/c | cx | eft | em | sf | sxt | cli | til） | enr | nor | va | |
注：直接填写检测的mic数值。
附件5
动物源细菌分离和鉴定方法
一、大肠杆菌、沙门氏菌的分离和鉴定
1.范围
本方法规定了用于耐药性测定的动物源大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定方法。
本方法适用于各种动物及其组织中大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定。
2.设备和材料
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：37℃±1℃和42℃。
2.3 显微镜：10×--100×。
2.4 采样管。
2.5 采样棉拭子、剪子。
2.6 灭菌试管。
2.7 平皿。
2.8 自动细菌鉴定仪。
2.9 api 20e试子条。
2.3 恒温摇床
2.4 冻存管
3.培养基和试剂
3.1 运送培养基
3.2 麦康凯琼脂
3.3 沙门氏菌显色琼脂或xlt4琼脂
3.4 营养肉汤
3.5 鉴定用大肠杆菌、沙门氏菌阳性血清
3.6 四硫磺酸盐增菌液（ttb）
4.大肠杆菌和沙门氏菌分离和鉴定程序
大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定程序见图1
动物泄殖腔拭子用接种环接种于麦康凯琼脂按1：10接种四硫磺酸盐增菌液（ttb）42℃24h 运送培养基或营养肉汤发病动物带菌组织（做成匀液）挑取大肠杆菌可疑菌落纯化氧化酶试验（阴性）沙门氏菌显色培养基或xlt4琼脂挑取沙门氏菌可疑菌落纯化 api 20e试条自动细菌鉴定仪大肠杆菌沙门氏菌检测inva基因确认三糖铁（tsi）和硫化物吲哚运动性培养基（sim）鉴定沙门氏菌大肠杆菌
5.操作步骤
5.1 采样
到已选定的养殖场或屠宰场，用灭菌棉签采动物泄殖腔样品，置入1-2ml肉汤或运送培养基中0-4℃保存。采发病动物组织时，用无菌操作取少量动物组织至于灭菌试管内，0-4℃保存，不超过48小时。
5.2 大肠杆菌的分离
5.2.1 取泄殖腔拭子样品用接种棒直接接种于麦康凯琼脂平面，动物组织样品首先制成匀液，然后用接种棒接种于麦康凯琼脂平面，37℃培养18-24小时。
5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的大肠杆菌可疑菌落，用麦康凯培养基纯化一代，然后接种于营养琼脂平面37℃培养12-24小时，待进一步细菌鉴定。
5.3 沙门氏菌的分离
5.3.1 将泄殖腔拭子或制成匀液的动物组织样品与增菌培养基按1：10的比例，接种于ttb增菌液中，42℃培养24小时。
5.3.2 将增菌液摇匀，用接种环接种于沙门氏菌显色培养基37℃培养22-24小时或xlt4琼脂上42℃培养22-24小时。
5.3.3 将沙门氏菌显色培养基上紫色的沙门氏菌可疑菌落或xlt4琼脂培养基上中央黑色边沿透明的沙门氏菌可疑菌落接种于营养琼脂平面37℃培养16-24小时，待进一步细菌鉴定。
5.4 大肠杆菌和沙门氏菌的鉴定（以下方法可任选其一）
5.4.1 api 20e试验条鉴定
5.4.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4 .1.2 将待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，用api 20e试子条按照使用说明书（附注2）操作，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养18-24小时，用细菌鉴定仪判读结果。
5.4.1.3 将鉴定出的大肠杆菌和沙门氏菌结冻保存，待进行药敏试验。
5.4.2 其它方法
5.4.2.1 大肠杆菌的鉴定
5.4.2.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4.2.1.2 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于三糖铁（tsi）琼脂中，37℃培养22-24小时，观察结果应表面黄色，h2s阴性，产气。
5.4.2.1.3 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于硫化物吲哚运动性培养基（sim），37℃培养22-24小时，观察结果应产气，h2s阴性，运动或不运动，吲哚阳性。
5.4.2.2 沙门氏菌的鉴定：设计inva基因的引物，上游为5′-gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa-3′，下游为5′-tca tcg cac cgt caa agg aac c -3′，反应条件：95℃预变性5min，94ºc 30s， 64ºc 30s， 72ºc 30s for 30 cycles，得到扩增长度为284 bp的扩增产物为沙门氏菌阳性。
附注1：氧化酶试验
1.原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素c氧化，然后氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素c的存在有关。
2.方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（10g/l盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/l盐酸二甲基对苯二胺水溶液）1滴，1min内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试验。
3.结果判定：阳性者立即变粉红色，5～10s内呈深紫色。阴性为无色。
4.注意事项： ①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/l盐酸四甲基对苯二胺或10g/l盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。
附注2：api 20e使用说明书
1.试子条的准备：将5ml蒸馏水或软化水注入培养盒底部的蜂窝小凹中，造成一个湿盒。
2.在盘的长边写上菌株号，，再将试条放入盒中。
3.取新鲜菌落1个悬浮于0.85%的生理盐水5ml中，按照要求用滴管滴加到试条中，cit、vp、gel试验滴满管部和杯部，其它试验仅滴满管部（注意滴加时小心，不能产生气泡）。
4.adh、ldc、odc、h2s、ure试验用矿物油覆盖，以造成厌气环境。
盖好盒盖，于37℃培养18-24小时。
5.试条判读：根据判读表判读所有反应（阳性或阴性），①如果有3个或3个以上试验为阳性，在报告单上记录结果后，观察还需要附加试剂的试验结果：tda试验、ind试验、vp试验，然后判读结果。②如果阳性结果少于3个，继续培养24小时，再进行判定。
6.结果判定：每3个试验为1组，阳性按顺序赋予1、2、4的数值，根据试子条上20个反应可得到一个7位数的编码（氧化酶反应作为第21个反应），根据数据库（v4.1）得到鉴定结果。也可将试子条直接插入计算机鉴定系统，直接得到结果。
二、金黄色葡萄球菌的分离鉴定
1.范围
本方法规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。
本方法适用于牛奶和发病动物组织中金黄色的分离和鉴定。
2.设备和材料
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。
2.2 恒温培养箱：37℃±1℃和42℃。
2.3 显微镜：10×--100×。
2.4 采样管。
2.5 灭菌试管。
2.6 平皿。
2.7 自动细菌鉴定仪。
2.8 api staph试子条。
2.9 恒温摇床
2.10 冻存管
3.培养基和试剂
3.1 baird－parker琼脂
3.2 营养肉汤
3.3 营养琼脂
3.4 新鲜兔血浆
3.5 0.3%过氧化氢液
4.金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序
金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图2
2000-3000 rpm，15 min弃上清 baird－parker琼脂灰色或黑小菌落，周围淡色、透明 营养琼脂增菌 api staph拭条鉴定金葡菌牛奶血浆凝固酶试验凝固金葡菌触酶试验阳性 扁桃体、发病动物组织
5.操作步骤
5.1 采样
5.1.1 牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶2ml，置入灭菌小离心管中，0-4℃保存，不超过48小时。
5.1.2 动物组织样品：无菌操作取发病动物组织，0℃-4℃保存不超过48小时。
5.2 金黄色葡萄球菌的分离
5.2.1 分离培养
5.2.1.1 将采样得到的牛奶样品，以2000～3000 r/min离心15 min，弃上清，用灭菌接种环醮起沉淀划线接种于baird－parker平皿，36℃培养24小时。
5.2.1.2 无菌操作将发病动物组织直接划线，接种于baird－parker平皿，36℃培养24小时。
5.2.2 挑取圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈的可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。
5.3 金黄色葡萄球菌的鉴定（以下方法可任选其一）
5.3.1 api staph试条鉴定
5.3.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验（附注3），应为阳性。
5.3.1.2 将待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，用api staph试子条按照使用说明书（附注4）操作，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养18-24小时，用细菌鉴定仪判读结果。
5.3.1.3 将鉴定出的金黄色葡萄球菌结冻保存，待进行药敏试验。
5.3.2 血浆凝固酶试验法
5.3.2.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验（附注3），应为阳性。
5.4.2.2 吸取1∶4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉汤培养物或生理盐水悬液0.5ml（1个麦氏单位），振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
5.4.2.3 如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，判为阳性结果。
附注3：触酶试验
用接种环挑取新鲜待检菌的纯化菌落置于洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液1 滴，观察结果。滴加3%过氧化氢溶液后立即产生气泡的为阳性。
附注4：api staph试子条按照使用说明书
1.试子条的准备：将5ml蒸馏水或软化水注入培养盒底部的蜂窝小凹中，造成一个湿盒。
2.在盘的长边写上菌株号（不记在盖上，以免错放），再将试条放入盒中。
3.取在血琼脂或营养琼脂上培养18-24小时的新鲜纯化、经触酶试验阳性的菌落，悬浮于0.85%的生理盐水5ml中，使其浓度等于0.5麦氏单位，按照要求用滴管滴加到试条小管中，试验仅滴满管部（注意滴加时小心，不能产生气泡）。
4.adh、ure用矿物油滴加到杯部，以造成厌气环境。盖好盒盖，于35℃--37℃培养18-24小时。
5.试条判读：加入试剂，观察反应： vp测定、nit测定、pal测定按照要求滴加试剂后进行判读阴性或阳性。
6.根据判读表判读所有反应（阳性或阴性）。
7.结果判定：每3个试验为1组，阳性按顺序赋予1、2、4的数值，根据试子条上20个反应可得到一个7位数的编码（触酶反应作为第21个反应），根据数据库（v4.1）得到鉴定结果。也可将试子条直接插入计算机鉴定系统，直接得到结果。
附件6
抗菌药敏感性试验操作规程和判断标准
一、抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法）操作方法
1．目的
本操作方法用来规范微量肉汤稀释法测定肠道杆菌最小抑菌浓度（mic）的操作，并统一判定标准。
2．适用范围
本标准操作规程适用于按照微量肉汤稀释法进行肠道杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度的测定（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌除外）。
3．职责
进行该试验的检验员应当按照本标准操作规程进行。
4．试验依据与原理
微量肉汤稀释法测定细菌最小抑菌浓度是定量检测某一抗生素对细菌体外活性的一种标准方法。试验在制成一系列各种浓度的抗生素肉汤溶液中分别加入等量的一定浓度的菌液，过夜培养后，判读最小抑菌浓度（mic）。
5．材料、仪器与试剂的准备及基本要求
5.1 材料和仪器
5.1.1 操作室：操作室内设有能达到空气消毒的紫外灯。实验前后应用75%乙醇溶液擦拭操作台面及可能污染的死角，开启紫外灯杀菌1小时。
5.1.2 旋涡混合振荡器：可调速
5.1.3 恒温培养箱：35±2℃
5.1.4 灭菌试管、容量瓶、刻度吸管等。
5.1.5 园底96孔板、接种针或接种环（镍铬丝或一次性无菌塑料制品）。
5.1.6 无菌衣、裤、帽、口罩：用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替。
5.1.7 8头或12头移液器、吸头等
5.2 试剂与培养基
5.2.1 75%乙醇溶液
5.2.2 无菌0.9%氯化钠溶液
5.2.3 新洁尔灭（1：1000）溶液
5.2.4 营养琼脂培养基
5.2.5 水解酪蛋白肉汤（mueller-hinton broth medium，mh肉汤，含20-25 mg钙/ l，10-12.5mg镁/l）
5.2.5.1 10mg/ml ca2＋ 和mg2＋的配制
ca2＋的配制：3.68g cacl2·2h2o加入100ml三蒸水中，含量为10mg ca＋＋/ml，0.22µm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
mg2＋的配制：8.36g mgcl2·6h2o加入100ml三蒸水中，含量为10mg mg＋＋/ml，0.22µm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
5.2.5.2 使用时加入适量的ca2＋和mg2＋到mh肉汤中，使mh肉汤中ca2＋和mg2＋的含量分别为20-25 mg ca2＋/ l和10-12.5mg mg2＋/l。
5.2.7 抗菌药物：一般采用标准品或对照品
5.3 质控菌种
5.3.1 肠道菌质控菌株：大肠杆菌atcc 25922。
5.3.2 金葡菌质控菌株：金黄色葡萄球菌atcc 29213。
5.4 抗菌药物贮备液的制备
5.4.1抗菌药物的称量
计算公式：
w（mg）=
式中：w-称取抗菌药物的重量；
v-制备抗菌药物的溶液体积；
c1-制备抗菌药物的溶液浓度；
c2-抗菌药物的含量。
5.4.2 加入一定量的溶剂稀释至一定浓度。贮备液的浓度至少应为1280µg/ml，或最高测试浓度的10倍以上。
5.4.3 将抗菌药物贮备液分装于无菌小瓶中，最好置-70℃以下保存，有效期为半年。注意不能反复冻融。临用前从冰箱中取出，使融解并与室温一致。
5.5 0.5麦氏单位（mcfarland）标准比浊液或比浊计
药敏试验菌悬液的浊度，以baso4浊度液为标准，相当于0.5麦氏单位（mcfarland），按如下方法配制：
5.5.1 取0.048mol/l的氯化钡溶液（1.175%w/v，bacl2·2h2o）0.5ml，加至99.5ml 0.18mol/l的硫酸溶液（1%v/v）中，不断搅拌使成混悬液。
5.5.2 用1cm光路的吸收池，在625nm下测定6.2.1的溶液，0.5标准麦氏单位（mcfarland standard）的吸收度应为0.08～0.10。
5.5.3 取4～6ml硫酸钡混悬液，置与稀释菌悬液相同规格的具塞试管中，密封，室温避光保存。
5.5.4 临用前将标准比浊液在漩涡震荡器上混合均匀，如出现大颗粒，则需重新配制。放置后硫酸钡标准比浊液的浊度会产生变化，因此应每月进行更换。
6 测定步骤
6.1 分离单菌落
将质控菌株和测试菌株分别用四分划线法转种于营养琼脂平面，置37℃培养箱中培养，以得到单个纯菌落。
6.2 抗生素工作溶液的制备
将抗菌药物贮备液用m－h肉汤稀释至一定的工作浓度后，按2倍稀释法进一步稀释至一系列所需浓度（一般10个浓度梯度），然后按顺序用排枪点入96孔板中，每块板横向10个稀释度，每孔0.1ml，设阴性和阳性对照，可测8个细菌。
6.3 菌液制备
6.3.1 生长法
6.3.1.1 用接种环挑取营养琼脂斜面上的3～5个质控菌或供试菌单个纯菌落，加入无菌4～5ml肉汤（如胰酶消化大豆肉汤）的试管中。
6.3.1.2 置35～37℃培养箱中培养，一般为2～6小时，使培养后的菌液浓度达到或超过0.5标准麦氏单位。
6.3.1.3 将培养好的菌液与比浊液管置比色卡上对着光源比较，适当情况下可用无菌生理盐水或肉汤稀释菌悬液，使两者浊度一致，即菌悬液的浓度为0.5标准麦氏单位，在该浓度下质控菌株atcc 25922的菌液浓度为1～2×108cfu。也可采用分光光度计测定并调节菌液浊度。
6.3.2 直接制备菌液法
该法较生长法简便，用接种环挑取琼脂平板上培养16～18小时的3～5个单菌落，用无菌生理盐水或m-h肉汤稀释至0.5麦氏单位。
6.3.3 将调节至0.5麦氏单位的菌液用m-h肉汤或生理盐水稀释100倍，约5x105-106cfu/ml浓度。
6.3.4 取5x105-106cfu/ml浓度的菌液0.1ml分别加入含系列抗菌药物溶液的板中， 混匀，试管中最终抗菌药物的浓度为原稀释浓度的一半。
6.4 培养
将加有菌液和抗菌药物的板，置35℃培养箱中培养16～20小时。
6.5 结果测定
取出培养后的板，观察结果，以无菌生长的最低抗菌药物溶液的浓度为最低抑菌浓度（mic）。
6.6 结果判断
在质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围（附注1和2）的前提下，按判断标准（附注1和2）判断被检菌株的敏感性－敏感，中度敏感或耐药。对于只给出敏感判断标准的药物，只报告其是否敏感即可。
7．注意事项
7.1 冷冻或冻干菌株应培养两代后才可用于测定。
7.2 调整好浊度的菌液应于15分钟内稀释至工作浓度。
7.3 m-h肉汤的质量对试验结果的影响
7.3.1 m-h肉汤是常规药敏试验中的最佳培养基，含磺胺，甲氧苄啶和四环素抑制剂较少，能满足大多数快速生长的需氧菌或兼性厌氧菌的营养需求。
7.3.2 试验一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的ph值应为7.2～7.4。
7.3.3 有些生产商能直接提供已调节阳离子浓度的m-h肉汤，否则需用原子吸收光谱仪测定。
7.3.4 新鲜配制的培养基，应按规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，所选用的化学试剂均应为分析纯。
7.3.5 如分离的菌种不典型或试验结果前后不一致时，应对菌种进行重新鉴定或重新进行药敏测定。
8. 名词解释
8.1 敏感 （susceptibillity， s）：表明该菌株所致感染可以用推荐的抗菌药物剂量进行治疗，除非存在禁忌症。
8.2 中介（intermediate， i）：用抗菌药物mic浓度治疗菌株感染，可使血液和组织中药物浓度接近通常可达到的水平，而抗生素治疗的反应率可能低于敏感株。意味着药物生理浓度部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和β－内酰胺类）或可用高于正常剂量的药物进行治疗（β－内酰胺类）。该类还包括一个缓冲区，可防止微小的，未能控制的技术因素造成的结果解释错误，特别是对那些安全范围窄的药物。
8.3 耐药（resistance， r）：指按常规剂量使用，抗生素通常达到的全身浓度不能抑制其生长的菌株，和/或某些抗菌药物的抑菌圈直径在耐药机制范围，且临床治疗效果不可靠。
9．参考文献
9.1 performance standards for antimicrobial susceptibility testing；fifteenth informational supplement.clinical and laboratory standards institute.
9.2 performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals；approved standard-second edition. clinical and laboratory standards institute.
9.3 methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically； approved standard-sixth edition. clinical and laboratory standards institute.
附注1 肠道杆菌药敏判定标准
| 药物 | mic判定标准（µg/ml） | 质控菌株mic范围（µg/ml） | |||
| s | i | r | atcc25922 | atcc35218 | |
| 氨苄西林（am） | ≤8 | 16 | ≥32 | 2-8 | |
| 阿莫西林/克拉维酸（a/c） | ≤8/4 | 16/8 | ≥32/16 | 2/1-8/4 | 4/2-16/8 |
| 头孢噻呋（cef） | ≤2 | 4 | ≥8 | 0.25-1 | |
| 庆大霉素（gm） | ≤4 | 8 | ≥16 | 0.25-1 | |
| 大观霉素（spt） | ≤32 | 64 | ≥128 | 8-64 | |
| 四环素（te） | ≤4 | 8 | ≥16 | 0.5-2 | |
| 多西环素（do） | ≤4 | 8 | ≥16 | -- | |
| 氟苯尼考（ffc） | ≤4 | 8 | ≥16 | 2-8 | |
| 磺胺异恶唑（sf） | ≤256 | - | ≥512 | 8-32 | |
| 复方新诺明（sxt） | ≤2/38 | - | ≥4/76 | ≤0.5/9.5 | |
| 恩诺沙星（enr） | ≤0.25 | 0.5-1 | ≥2 | 0.008-0.03 | |
| 氧氟沙星（ofl） | ≤2 | 4 | ≥8 | 0.015-0.12 | |
| 多粘菌素e（pme） | ≤2** | 4 | ≥8** | 0.25-1 | |
注： **表示参考其他判定标准.
附注2 金黄色葡萄球菌药敏判定标准
| 药物 | mic判定标准（µg/ml） | 质控菌株mic范围（µg/ml） | |||
| s | i | r | atcc29213 | atcc35218 | |
| 青霉素（p） | ≤0.12 | - | ≥0.25 | 0.25-2 | |
| 氨苄西林（am） | ≤0.25 | - | ≥0.5 | 0.5-2 | |
| 阿莫西林/克拉维酸（a/c） | ≤4/2 | - | ≥8/4 | 0.12/0.06-0.5/0.25 | 4/2-16/8 |
| 头孢西丁（cx） | ≤4 | - | ≥8 | 1-4 | |
| 头孢噻呋（cef） | ≤2 | 4 | ≥8 | 0.25-1 | |
| 红霉素（em） | ≤0.5 | 1-4 | ≥8 | 0.25-1 | |
| 磺胺异恶唑（sf） | ≤256 | - | ≥512 | 32-128 | |
| 复方新诺明（sxt） | ≤2/38 | - | ≥4/76 | ≤0.5/9.5 | |
| 克林霉素（cli） | ≤0.5 | 1-2 | ≥4 | 0.06-0.25 | |
| 替米考星（til） | ≤8 | 16 | ≥32 | 1-4 | |
| 恩诺沙星（enr） | ≤0.5 | 1-2 | ≥4 | 0.03-0.12 | |
| 氧氟沙星（ofl） | ≤1 | 2 | ≥4 | 0.12-1 | |
| 万古霉素（va） | ≤2 | 4-8 | ≥16 | 0.5-2 | |
